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组学实验-转录组测序

组学实验-转录组测序

  • 所属分类:组学实验服务
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  • 发布时间:2022-02-16 17:06:09
  • 产品概述

产品介绍

转录组测序的研究对象为特定细胞或组织在某一功能状态下转录出来的mRNA集合,通过oligo-dT磁珠捕获带polyA尾的RNA进行建库测序,也称为PolyA-Seq。可研究mRNA差异表达或检测结构变异,筛选与疾病或性状相关的分子标记;还可揭示转录组的复杂性,确定基因以及转录本结构、可变剪接、RNA编辑、带polyA尾的非编码RNA 和新转录本。目前已广泛应用于基础研究、分子育种、临床诊断和药物研发等领域。

• Total RNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的Total RNA。组学实验

• RNA质量检测:Nanodrop检测RNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳及Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品完整性。

• mRNA捕获:采用oligo-dT磁珠捕获带Poly A结构的mRNA

• RNA片段化:采用mg2+离子打断的方法,将RNA片段化至200-300bp。

• cDNA合成:随机引物反转录合成cDNA第①链;在合成cDNA第二链时掺入dUTP标记第二链,保留了RNA的链方向性(可选)。双荧光素酶实验

• 加A尾,接头连接:cDNA两端引入接头序列及标记样品的index序列。

• PCR富集:PCR富集文库片段,文库大小为300-400bp。

• 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。

样品要求

• 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

• 样品量:细胞样品请提供至少1×106个细胞,组织样品请提供至少100 mg的组织块或切片,RNA样品请提供5 μg以上的总RNA。

• 样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA,OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。

• 样品保存:

 细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃。

 组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃。

RNA样品:可将RNA溶于RNase Free 的超纯水中,-80℃保存。细胞动物整体实验

 样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰运输。

测序方案

测序模式 PE150

测序数据量 6Gb clean data

生物信息分析内容

1 原始数据质控检查

2 比对结果质控检查

3 基于基因表达的样品主成分分析

4 差异基因表达分析

5 差异基因GO功能分析

6 差异基因通路分析

7 变异剪切分析

8 基因突变分析

9 转录调控活性分析及通路互作分析

 


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