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组学实验-蛋白质组学

组学实验-蛋白质组学

  • 所属分类:组学实验服务
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  • 发布时间:2022-02-16 16:34:42
  • 产品概述

蛋白质组学介绍

 

       蛋白质组(Proteome)是指基因组表达的所有相应蛋白质的集合,即细胞、组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学(Proteomics)是指利用高分辨的蛋白质分离技术和高效的蛋白质鉴定技术在蛋白质水平上整体性、动态和定量地研究生命现象及规律的科学,是系统生物学的有机组成部分。

蛋白质组是空间和时间上动态变化着的整体,一个基因组对应多个蛋白质组。相比稳定的基因组,蛋白质组是遗传信息、环境因素、生活习惯等多因素的综合体现。同一细胞/组织,在不同时间/不同环境条件下蛋白谱的表达也存在不同。如上图所示:线粒体呼吸链酶家族的蛋白表达水平不仅在不同成人器官中存在显著差异,同样在心脏中,胎儿与成人蛋白表达量也差异巨大。因此,蛋白质组是能实时反映细胞/组织功能和疾病发生状态的一类分子,也是疾病发生相关的分子类型,具有广阔研究前景。组学实验

 

蛋白质组学定性原理

 

      随着高效液相分离技术(HPLC)和静电场轨道阱(Orbitrap)质谱技术的发展,液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)成为目前蛋白质组学分析的主要技术。其鉴定蛋白质的基本步骤(bottom-up):收集样本后进行总蛋白质提取→消化切割蛋白为多肽片段→HPLC分离→分级进入MS电场进一步离子化→MS获得各离子质荷比和峰型信息→软件计算氨基酸组成→数据库检索比对获得蛋白质的定性和序列信息。双荧光素酶实验

 

同位素标记定量原理

 

       基于LC-MS/MS技术的蛋白质组定量技术一般分为标记法和非标记法两种类型。目前常用的标记法有:iTRAQ(体外)、TMT(体外)、SILAC(体内)三种基于同位素标签进行半定量的方法。以常用的iTRAQ蛋白质组学定量为例:iTRAQ是由8种(113/114/115/116/117/118/119/121)同位素标签组成,在实验过程中将8例不同样品分别酶解成多肽片段→分别标记8种同位素标签→将8例标记好的多肽样品混合成1例总样品→进入LC-MS/MS分析系统→二级MS阶段iTRAQ平衡基团发生中性丢失,在低质量区产生多个报告离子→计算各报告离子峰面积,获得同一肽段不同样品间的相对丰度差异比值→加权计算肽段丰度获得总蛋白质相对定量值。细胞动物整体实验

 

Label Free定量原理

 

      蛋白质非标记定量技术(Label Free),是直接通过液相色谱质谱(LC-MS)技术结合复杂的数据分析方法对蛋白质酶解肽段进行半定量检测的技术。目前Label Free主要的数据分析方法是利用Maxquant软件,根据一级质谱相关的肽段峰强度、峰面积、液相色谱保留时间等信息进行定量分析的方法;

      相比较iTRAQ/TMT等标记方法,Label Free具有特定的技术优势:a. 检测起始样本量少; b. 前处理少,更多保留样本原始信息;c. 对于低丰度多肽的覆盖程度更高;d. 不受标记试剂盒限制,可进行大批量的样本检测。

 

主要仪器设备

 

Q Exactive™ Plus 组合型四极杆 Orbitrap™ 质谱仪
分辨率:140000 at m/z 200,可选 280000 at m/z 200
扫描速率:zui高12 HZ
质量数范围:m/z 50- 6000 
应用范围:高通量蛋白质鉴定——复杂样品
                 定量蛋白质组学——iTRAQ/TMT定量
                 修饰蛋白组分析  

 

样品要求

 

 

应用方向

 ◇   发病机理研究
 ◇   药物靶点研究
 ◇   疾病标志物筛选
 ◇   植物品种改良
 ◇   工程菌改造
 ◇   特殊功能蛋白质筛选


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