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双荧光素酶实验-双荧光素酶实验

双荧光素酶实验-双荧光素酶实验

  • 所属分类:细胞实验技术服务
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  • 发布时间:2022-02-15 15:54:05
  • 产品概述

双荧光素酶报告基因的检测

近年来,非编码RNA(Non-coding RNA)的研究成为热点,特别是microRNA的研究。当发现一个新的miRNA,并研究其是否对相关疾病具有调控作用时,就需先对它和靶基因的调控关系做一验证,而目前常用的靶向关系的验证方法就是:双荧光素酶报告基因检测。本文就相关检测原理、萤火虫荧光素酶、海肾萤光素酶、报告基因、检测步骤、细胞裂解及Luciferase检测作简单介绍。

检测原理

由于miRNA主要是通过作用于靶基因的3'UTR区域,这样就可以将目的基因3'UTR区域构建至含有报告基因萤光素酶的载体上,通过比较miRNA mimics或miRNA inhibitor作用后报告基因表达的改变(监测萤光素酶的活性变化)可以定量反映出miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法还可以进一步确定miRNA与靶基因3'UTR的作用位点。

萤火虫萤光素酶

萤火虫荧光素是从甲虫(Photinus pyralis)中分离得到,分子量为61kDa的蛋白,在ATP、镁离子和氧气存在的条件下,可以催化荧光素(luciferin)氧化成氧化荧光素(oxyluciferin),在luciferin氧化的过程中,会发出生物萤光(bioluminescence)。萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的z强发光波长为560nm。

海肾萤光素酶

海肾(Renilla)荧光素酶则是从海肾(Renilla reniformis)中分离,分子量为36kDa的蛋白,在氧气存在的条件下,可以催化腔肠素(coelenterazine)发生氧化,在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光(bioluminescence)。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的z强发光波长为465nm。

生物萤光可以通过荧光酶标仪进行测定,从而对实验结果进行定量。

报告基因

报告基因(report gene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因,可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。

检测步骤

常规培养细胞后进行细胞转染:

(1)转染前一天将细胞计数,取2mL加入6孔板中,使得孔板的细胞密度不低于5*105个;

(2)对于每孔细胞,用250uL的无血清培养基稀释2μg DNA(质粒),室温孵育5min;

(3)对于每孔细胞,用250uL的无血清培养基稀释5uL Lipo2000,室温孵育5min;

(4) 将2和3中的液体混合,室温孵育20min;

(5) 将预先分好的贴壁细胞换成无血清培养基,加入上述复合物,在37℃,5%的CO2中培养6h,再换成完全培养基,继续在37℃,5%的CO2中培养,72h检测转染水平。

细胞裂解及Luciferase检测

 

RLU值的计算:在以海肾萤光素酶为内参的情况下,用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU1值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU2值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参,也可以进行类似计算。

 


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