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干货分享:设计完美蛋白组学实验的方法

2023-05-24 10:59:35

个步骤让您拥有良好蛋白组学实验设计






成功的实验具有可重复性,且不会因为实验室条件的不同该改变。实验设计所用的技术、深入的处理方法都非常重要。下图展示的是实验设计的基础流程,可帮助研究者无偏差而高效的完成蛋白组学实验。





1.明确实验目标和相关响应变量






首先要明确实验目标,如“将测量什么”、“和哪个样品组进行比较”等,这些是将要研究的响应变量和实验因素,以确定它们对实验结果的影响。响应变量是用来回答研究问题的实验成果,在定量蛋白组学中是肽链或蛋白的丰度,在蛋白组学中是不同样本中的差异蛋白。选择实验方法至关重要,有MRM、DDA、DIA等可选项。另外,还需要评估效应大小以判断需要的样品用量。在早期的biomarker筛选阶段,只要是显著差异的就行,而在毒性研究中只有引起生理差异的才有价值。





2.列举相关因素






相关因素是影响响应变量的潜在因素。理想情况下响应只受实验系统中生理性质的影响,但实际情况复杂得多。如肽段峰面积不仅取决于该肽的丰度,还取决于电喷雾的稳定性、色谱柱残留和蛋白水解效率。在实验中改变的因素称为实验因素,它们对所有样本的影响不一定都相同,例如试剂批次、一天运行LC-MS时的上样顺序和人为因素等,因此需要尽量将这些因素的影响降到可能小。





3.设置对照样本和质量控制步骤






在此可以设置2种对照:实验对照和质控样品。前者保证样品性质如保留时间、m/z和丰度信息的准确性,后者可以设置已知丰度的蛋白,以评估仪器检测的准确性。质控样本可以告知我们仪器是否正常运行,以及性能如何。评估有性能的分析软件有NIST、QuaMeter tool和SProCoP等。





4.优化实验流程






供应商的Protocols为实验提供了关键部分的详细流程,但为确保实验正常进行还需调整多种参数。如安捷伦喷射流电喷雾电离源具有六种调节功能,有干燥气体温度、雾化器电压和毛细管电压等。但要使实验系统整体正常运行,还需要调整其他许多参数。幸运的是有很多系统方法可以优化设置,如RSM(Response Surface Methodology)。在发表的文章中也可找到多种优化参数、提高蛋白组学性能结果的例子。





5.估算样品数量






研究中需要避免因为样品重复和技术重复不够的问题,否则会出现假阳性/假阴性结果。因此,我们必须评估需要多少样品并设计相应实验。这将涉及2点:一是我们探究的影响(信号)有多大,另外一个是组间样品的响应变量情况。通过预实验来检测噪音水平是实验设计的关键步骤。作者推荐每组中至少设置10个独立样本以评估其变量,一个生物样本测定5次。这将花费不菲,但从中获得的知识是成功进行后续实验的关键。





6.进行实验






一个好的实验设计应该能回答研究问题,并且不会产生有偏差的实验结果。现代实验设计可以追溯到R.A. Fisher在1926年发表的工作。他奠定了实验设计的三大里程碑:封阻、随机性和重复性,前两者可消除偏差,第三者可以增加信号-噪音的比率,得到更准确的结果。


 


01

封阻




很多因素会随着实验的进行而改变,如试剂批次、人为因素、日期等等。封阻是解决以上问题的办法。运行一个小的平衡实验。例如,如果每天只能运行八个样本,那么可以从两个组中各选择4个样本进行实验,如此一来,响应变量的任何变化对2个组中的影响都相同。




02

随机性




有些实验无法很好进行封阻,例如96孔板的边缘对实验结果有影响,这时候随机分布样本就能简单有效的解决这个问题。随机可以抵消未知因素引起的结果偏差,这在纵向收集样本时尤为重要。图2展示了一个随机实验设计的例子。



 


03

重复性




设置重复的目的是减少随机测量偏差。重复分为生物学重复(多个独立随机样本)和技术重复(多次测试),前者可以反映群落的整体情况,后者能消除实验过程的噪音。例如,病人对治疗的响应各不相同,一个样本得到的结果可能和群体平均信息相差巨大,因此需要设置多个样本。而当实验室程序引入的可变性达到或大于种群可变性的规模时,技术重复就显得更重要了。像蛋白质鉴定实验中,通常依赖重复运行LC-MS/MS积累的数据来完善蛋白质鉴定结果,那些变化大的步骤可通过流程优化或技术重复来补救。
 
设置盲实验能使结果更加具有说服力,对照样本也是实验中必须包含的部分,阴性/阳性样本能验证整个实验工作流程是否正常运行,让研究者解释阳性结果的正确性。



7.统计分析





目前有很多分析平台可以对蛋白组学数据进行免费处理,包括蛋白鉴定、蛋白定量和统计分析。常用的方法是t检验和ANOVA,当然,也可以选择非参数检验方法。进行封阻实验的,在分析时还必须将其考虑在内(以便在评估噪声水平时忽略这些变量可能存在的巨大差异)。值得注意的是,统计方法必须与研究问题及实验设计相匹配。


组学实验


总  结



执行一个好的实验设计并不会比执行差的设计花费更多努力。R. A. Fisher提出的三个重要准则是封阻、随机和重复。建立正确的QCs能消除因系统因素而造成的实验误差,也能检测到长期运行时性能的改变。鼓励大家通过公共存储库(如proteomexchange.org)分享蛋白组学数据,这能减少不必要的重复研究,而且也能比较相似数据集的质量和准确性。目前尚无运行LC-MS的质量控制标准,而共享这些信息可以大大简化调试和优化蛋白质组学实验的过程。细胞动物整体实验



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