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双荧光素酶报告基因实验

2023-04-24 10:51:58
检测原理


萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下,催化荧光素氧化,生成氧化荧光素,同时产生黄绿色光,波长540-600nm,一般检测时选用560nm。

海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光,波长460-540nm,一般检测时选用460nm。

不同于绿色荧光蛋白(GFP)需要一定的光激发才能发光,且易淬灭;荧光素酶经过反应本身就可以自发荧光,并且只有在底物存在时才能发光。因此GFP只能用于标记或检测反应是否发生,而荧光素酶报告实验却能通过荧光值定量分析荧光素酶的表达水平。


应用方向


荧光素酶作为一种理想的报告基因,可用于启动子研究、miRNA研究、信号转导通路研究等等。

在报告基因的5'端加上待检测基因的启动子,就可以用来检测转录因子对启动子的作用,启动转录越多,那报告基因的表达量就越大,荧光值越高。如果在报告基因的3'端加上目的基因的3'UTR,就能用来检测miRNA对于目的基因的调控(抑制作用),报告基因表达越少,说明miRNA的作用就越强。

一般情况下,海肾荧光素酶基因作为内对照使用,将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞;或是将两个报告基因构建到同一个质粒上,分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时,将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值,这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响,使测试结果不受实验条件变化的干扰。


常见问题分析


正是由于报告基因检测结果受多种因素影响,如载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等,一旦某个细节处理不好,都可能导致实验失败或结果的不准确。小翊为此精心整理了大家实验过程中遇到的几类常见的问题和解决办法。


1.荧光值过高

荧光值过高可能会超出仪器检测范围,从而检测不到值,一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决:



a. 减少质粒转染量;

b. 细胞样品裂解后,离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。

注:不建议通过减少底物量来降低荧光值,需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平,否则会造成检测结果出现大的偏差。


2.荧光值过低或无荧光值

荧光素酶的表达水平与启动子活性相关,正常表达水平下检测到的荧光值应在105数量级左右,若检测到的荧光值比较低或无荧光值,可从启动子活性、转染效率、检测过程这几方面进行考虑:



转染效率低

a. 优化转染实验条件,用较易转染的质粒做阳性对照(如转染过表达荧光蛋白质粒);

b. 确保转染DNA的质量,可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定;

c. 选择活性较高,处于指数分裂期的细胞进行转染。



启动子活性低或诱导失败

a. 转染后的细胞培养使用特异性诱导启动子的条件;

b. 优化细胞的培养条件,提高荧光素酶的表达量;

c. 更换强启动子(如SV40、CMV)。

注:海肾荧光素酶基因作为内对照,其表达应不受时期、部位、环境影响,因此常用组成型表达的TK启动子。



样品裂解效率低

a. 细胞培养时间不宜过长,12-36h内比较好,长时间培养后,细胞可能会难裂解。

b. 加入的裂解液需足量,保证细胞能够充分裂解。



检测过程操作不规范

a. 选择合适的检测仪器,能够检测化学发光或者生物发光的仪器都适用于该实验;

b. 需加入足量底物,保证底物的饱和,否则会造成检测结果出现很大偏差;

c. 室温反应。反应时各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温;

d. 荧光素酶的半衰期一般约30min,加完底物后可立即检测,尽量在30min内完成。



底物氧化失效

a. 底物避光密封保存,萤火虫荧光素酶底物-20℃保存;海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存;

b. 反应工作液建议现用现配。


3.复孔重复性差

报告基因检测实验受多种因素影响,因此同批次样品检测值也可能出现浮动。除了引入另一个报告基因作为内参照避免实验条件变化的干扰之外,一般还需设置3个或3个以上复孔。想要得到一个准确的结果,应尽可能减小复孔之间的差异性:



a. 细胞裂解后建议离心取上清,保证样本的均一性;

b. 保证加样的准确性,移液器需定期校准,确保移液精准;

注:荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏,复孔之间的数值有一定差异是正常的,一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。


2.1

miRNA靶基因验证

实验原理

miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

案列介绍

题目: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer

期刊: Nature Communications

小结:验证B4GALT3(β-1,4-半乳糖基转移酶III)基因具有miR-1247-3p的靶向结合位点。将B4GALT3预测结合位点的序列克隆到报告基因载体,同时构建靶位点突变的载体,分别共转miR-1247-3p mimics及NC mimics,结果显示转染miR-1247-3p 的WT组相对荧光值降低,MUT组不变,提示存在靶向结合。


  Tian Fang et al.,Nature communications2018

相关实验:miRNA同lncRNA/circRNA靶向互作


2.2

启动子活性验证

实验原理

转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子,通过共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

案列介绍

题目:Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop

期刊:Nature Neuroscience

小结:验证Sox9在Sox2启动子区有多个结合位点,构建不同的启动子片段到报告基因载体中,共表达Sox9,显示插入片段的缩短和推测结合位点的减少,荧光素酶活性也随之下调。

Jun Wang et al.,Nature neuroscience,2018

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3 技术路线

根据实验目的设计实验方案—预测结合位点--构建野生/突变报告基因载体系统---共转染细胞---检测酶活


常用靶基因结合位点预测网址:

http://www.targetscan.org/

http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_dyn_data.html

http://www.mirbase.org/


常用转录因子结合位点预测网址:

http://jaspardev.genereg.net/

http://www.genomatix.de/

http://alggen.lsi.upc.es

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4常见应用方向总结

(1)验证miRNA同mRNA靶向互作。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该miRNA,如果萤光素酶活性下降,则提示为其靶序列。 


(2) 验证miRNA同circRNA靶向互作。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素酶活性。 


(3) 验证miRNA同lncRNA靶向互作。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素酶活性。


(4)启动子活性分析。将启动子区域序列进行分段截短,再分别构建入报告基因载体,检测其启动子活性。


(5) 验证特定转录因子同启动子的作用。将启动子区域插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转该转录因子,分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。 


(6)分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,萤光素酶活性代表了通路的下游响应。组学实验

双荧光素酶报告基因检测常用载体

   双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略。一是两种荧光素分别位于两个载体上,第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。


策略一两种荧光素分别位于两个载体。

(1)pRL-TK质粒(海肾荧光素酶Rluc载体):

(2)pGL3-Basic质粒(萤火虫荧光素酶Luc载体

将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞,通过计算萤火虫荧光素酶检测值海肾荧光素酶检测值的比值即可计算出过表达或者敲降转录因子转录调控元件的影响


第二种策略两种荧光素位于同一个载体

pmir-GLO质粒海肾荧光素酶(hRluc-neo fusion)与萤火虫荧光素酶(Luc2)构建到一个质粒载体,比双质粒共转染更加便捷。双荧光素酶实验


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