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双萤光素酶实验的具体步骤

2022-11-18 15:55:14

1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上,如pGL3-basic。

2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞,根据需要对细胞进行处理。共转染时,由于内参具有很强的启动子,因此报告基因质粒:内参转染量一般为10:1~50:1。天津组学实验

Luciferase活性测定:

⑴ 初次使用时,配制LAR II,即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中,并分装-80℃避光保存。

天津组学实验,双荧光素酶实验,qPCR

⑵ 加入1X PLB,室温裂解细胞15 min。

⑶配制Stop&Glo,即Renilla luciferase的底物,能够终止LAR II的反应。双荧光素酶实验

⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液,吹打混匀后,检测读数,即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo,再次读数,即为Renilla luciferase的值。qPCR

⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值,再以control组的比值为单位1,即可得到不同处理组的相对luciferase活性,也就是该处理组基因转录的调控活性。


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